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EMSA及Footprinting 实验服务

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所属分类:EMSA及Footprinting 实验服务
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EMSA及Footprinting 实验服务已经通过EMSA等实验证明转录调控蛋白可以结合DNA,但是需要通过DNase I足迹分析实验来进一步精确鉴定蛋白结合的DNA序列,以便研究其转录调控的机制。

EMSA及Footprinting 实验服务产品概述:

DNase I footprinting assay(DNase I足迹分析实验)可以精确鉴定DNA结合蛋白(如转录调控蛋白)在DNA分子上的结合位点。转录调控蛋白通过与启动子区域结合来调控靶标基因的转录。目前,凝胶阻滞实验(EMSA)和DNase I足迹分析实验是重要的一套体外研究工具:凝胶阻滞实验可以确定转录因子是否与DNA直接结合,而DNase I足迹分析实验则可以精确鉴定其结合的DNA序列,从而帮助我们研究基因转录调控的机制。经典的DNase I足迹分析实验需要使用同位素进行标记,并在反应完成后通过跑原始的DNA测序胶来检测;该方法不仅危险,而且费时、对操作者的技术要求高、成功率低。针对这种情况,上海伯豪目前推出利用“荧光标记”结合ABI测序仪的方法来进行DNase I足迹分析实验。 


一、EMSA及Footprinting 实验服务的优势: 

1.相对于“同位素标记”,“荧光标记”更安全、无污染; 
2.“荧光标记”,实验的速度快、重复性好、灵敏度高。 


 

● 荧光标记法,由于可以进行DNA的精确定量,并可以在常规的实验台上面操作;同位素标记法只能通过放射性强度来估测,且操作时需要特别的保护装置,操作不便。因此,荧光标记法的可重复性要远远好于同位素操作。 
● 原始的PAGE测序胶对操作者的技术要求很高,且条带的清晰度受到多种实验因素的影响;ABI测序仪的操作体系非常成熟,灵敏度高,重复性好。因此,荧光标记法更灵敏度,获得的保护区域更清晰,图片的质量更好。 

 

二、EMSA及Footprinting 实验服务实验及数据分析流程:

 

三、实例分析:


原文:Characterization of a New GlnR Binding Box in the Promoter of amtB in Streptomyces coelicolor Inferred a PhoP/GlnR Competitive Binding Mechanism for Transcriptional Regulation of amtB. Journal of Bacteriology. 2012,194(19):5237-44.

 

四、服务说明: 
● 该服务适用于:已经通过EMSA等实验证明转录调控蛋白可以结合DNA,但是需要通过DNase I足迹分析实验来进一步精确鉴定蛋白结合的DNA序列,以便研究其转录调控的机制。客户需要提供纯化的蛋白,DNA样品及引物序列,同时需要提供EMSA结果图及实验参数以便于接下来的DNase I足迹分析实验。 
● 公司同时提供蛋白纯化或者EMSA实验验证,但需另计费用。 
● 本服务同样适用于mRNA转录起始位点的鉴定,原理与DNase I足迹分析实验类似,即在Primer extension实验或者S1 mapping实验中用荧光标记法替代同位素标记法。客户需要提供高质量的RNA样品及目的基因序列。

 

五、近年来使用该技术发表的部分论文: 
1, Structural and functional analysis of the transcriptional regulator Rv3066 of Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 2012,40(18):9340-55. 
2, LVIS553 Transcriptional Regulator Specifically Recognizes Novobiocin as an Effector Molecule. J Biol Chem. 2010,285(22):16921-30 
5, Detailed analysis of the DNA recognition motifs of the Xanthomonas type III effectors AvrBs3 and AvrBs3Δrep16. Plant J. 2009,59 (6): 859–871. 
4, A key developmental regulator controls the synthesis of the antibiotic erythromycin in Saccharopolyspora erythraea. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008,105(32):11346-51. 
5, A Pseudomonas aeruginosa transcription factor that senses fatty acid structure. Mol Microbiol. 2007,66(3):622-32. 
6, Anaplasma phagocytophilum p44 mRNA expression is differentially regulated in mammalian and tick host cells: involvement of the DNA binding protein ApxR. J Bacteriol. 2007,189 (23): 8651-9. 

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